引言
結合疫苗，尤其是針對2歲以下兒童的疫苗，通過將多糖與蛋白載體偶聯，可以提高免疫原性。然而，實驗過程中發現，利用白喉減毒毒素(CRM197蛋白)作為載體蛋白而制成的結合疫苗，會存在游離蛋白，影響藥物品質，且通過傳統方式難以精確檢出，具有較高的安全隱患。
艾美衛信生物藥業(浙江)有限公司開發的高效液相色譜(HPLC)測定方法，采用了SRT SEC-300(7.8×300mm)色譜柱，配合特定的色譜條件，實現了對游離CRM197蛋白含量的精確測定。與競品色譜柱相比，SRT SEC-300色譜柱具有更高的分離度和信噪比，能夠更有效地將CRM197蛋白從結合物中分離出來，顯著提升了檢測的靈敏度和精確度。此外，該方法優化了柱溫和pH值，確保了方法的穩定性和重復性(專利號CN110018253A，點擊文末閱讀原文查詢文章)。
背景介紹
多糖疫苗抗原(CPS)屬于胸腺非依賴性抗原(TI-Ag)，無法充分激發兒童的免疫系統。通過將多糖與蛋白載體偶聯，制成結合疫苗，可以將TI-Ag轉變為胸腺依賴性抗原(TD-Ag)，從而增強免疫原性，為兒童提供長期保護。然而，在制備結合疫苗的過程中，游離蛋白可能會影響疫苗的免疫效果，甚至引發不良反應。因此，精確檢測其含量變得尤為關鍵。
目前，檢測結合疫苗中游離蛋白含量的方法主要是《中國藥典》記載的HPLC法。方法的建立，也受到載體蛋白的性質、檢測分析柱的選型等各方面的影響。本專利采用賽分科技SRT SEC-300色譜柱，實現了對結合疫苗中游離CRM197蛋白含量的精確測定，保證了精確度與重復性，降低了檢測成本，簡化了操作流程，有望成為結合疫苗質量控制中的重要工具，為疫苗的安全性和有效性提供強有力的技術保障。
文章概述
在疫苗研究領域，精準測定游離蛋白含量對于確保疫苗的安全性和有效性至關重要。本專利采用賽分科技SRT SEC-300色譜柱，通過優化條件，能夠精確測定出結合疫苗中的游離蛋白含量；同時，實驗可以將CRM197蛋白的檢測限確定在0.15625μg，定量限約為0.625μg，反映了SRT SEC-300(7.8×300mm)色譜柱在低濃度樣品中的高靈敏度和準確性，能夠減少待測樣品的用量，從而降低游離蛋白的檢測成本。該方法在疫苗研發、藥物篩選評估等方面具有重大意義。
精確度考察
本專利以腦膜炎球菌多糖結合疫苗、b型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗、肺炎鏈球菌多糖結合疫苗作為測定樣品，依次命名為結合物a、結合物b、結合物c。將樣品用0.2M氯化鈉稀釋樣品至蛋白濃度為200μg/mL，各取1mL，分別加入0wt%、1wt%、3wt%、5wt%的CRM197蛋白。以加樣回收率來考察精確度，每個樣品檢測3次進行重復性判定。
色譜柱：SRT SEC-300(7.8×300mm,5μm,300Å)
流動相：0.2M NaCl(pH7.2±0.02)
柱溫：23±1℃
流速：0.5mL/min
紫外檢測波長：UV280nm
固定進樣體積：100μL
結果如下：
圖1.結合物a+CRM197蛋白
圖2.結合物b+CRM197蛋白
圖3.結合物c+CRM197蛋白
圖1-圖3是向三種結合物加入不同濃度CRM197蛋白的檢測結果。由圖可知，在設定的試驗參數和條件下，SRT SEC-300色譜柱分離度較好(＞1.70)，可重復性高。且進一步計算發現，回收率皆處于80-120%之間，CV%皆小于5%，滿足質量標準要求，表示本檢測方法準確可信。
表1.不同濃度CRM197蛋白的信噪比
表1是向三種結合物加入不同濃度CRM197蛋白所測得的信噪比。根據檢測結果，可以確定有無CRM197蛋白的檢測限約在0.15625μg，再結合行業標準中信噪比＞10.0的規定，可以確定CRM197蛋白含量的定量限在0.625μg左右。
根據定量限的數值，大致可以確定進樣樣品中總蛋白含量最小應在12.5μg以上為佳。本專利中，進樣樣品中總蛋白含量在20-50μg，可有效降低樣品的使用量，具有檢測結果精確、檢測成本低的特點。
實驗結論
綜上所述，SRT SEC-300色譜柱，展現出了快速、高效的分離性能，能夠在確保高分離度的同時，維持良好的信噪比，在特定的柱溫和pH條件下，能夠滿足對游離蛋白含量精確測定的高標準要求，這對于保證結合疫苗的安全性和有效性至關重要。
產品介紹
賽分科技SEC系列色譜柱，采用特有的表面修飾技術，分離速度快，分辨率高，通用性好，批次重現性強，適用于質控QC放行，也是分析型SEC值得信賴的產品。
圖2.賽分科技SEC固定相表面修飾工藝
“-C”系列產品，采用賽分科技獨有的固定相修飾工藝（見圖2），硅膠表面鍵合一層“平躺”的單分子層，最大程度減少非特異性相互作用。“-C”系列產品適用于疏水性較強的樣品，可以減少有機相的使用，安全、環保，讓您的實驗無后顧之憂。
延展閱讀
體積排阻色譜法適用于從小規模實驗室研究到大規模工業生產的廣泛需求。賽分科技SEC系列產品具有柱容量大、操作簡單、易于自動化的特點，能夠穩定、連續地處理大量樣品，滿足治療性蛋白在疫苗研制、臨床試驗乃至商業化生產中的高通量需求。
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