引言
Introduction
單克隆抗體（mAb）的互補決定區（Complementarity-Determining Region，CDR）中氨基酸的氧化修飾會顯著影響抗體與抗原結合的能力以及生物學活性。在2020版中國藥典中，對mAb供試品氧化產物等雜質進行定量分析，是單抗制品檢定的重要指標之一。近期，賽分科技客戶復宏漢霖于ACS Pharmacol.Transl.Sci.上發表相關文章（*點擊底部左下角“閱讀原文”獲取文章鏈接）。文中介紹了一種基于疏水相互作用色譜（HIC）的方法，用于量化和表征CDR區域中的甲硫氨酸氧化變體（Met-Ox）。研究人員利用Proteomix HIC Butyl-NP5疏水分析柱及半制備柱，成功分離和富集目標單抗的氧化變體。賽分科技HIC色譜柱在異質體分離方面效果顯著，不僅適用于抗體的分析和穩定性評估，而且對樣品制備和生物學功能研究提供重要支持。
背景介紹
IgG類抗體是目前臨床治療中最常用的抗體類型之一。對于IgG而言，氧化修飾作為質量檢驗的一個重要指標，在評價抗體的穩定性和功能性方面至關重要，特別是Met-Ox對抗體與抗原之間的親和力有著直接影響。在實際研發生產中，可采用半制備的方式來分離這些氧化變體，從而進行進一步的體外和體內特性研究，以評估抗體性能。
當前，測定Met-Ox通常采用C18或PS-DVB基質的反相色譜柱進行方法開發，但這種方法往往會導致抗體生物活性受損，不利于后續實驗。為了解決這個問題，研究人員選擇了賽分科技的Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色譜柱，可以有效分離目標氧化變體，同時保證產品質量和一致性。
文章概述
本研究通過對特定條件下不同時間點（從0.5 h至24 h）處理的目標抗體mAb-A進行了系統的研究，考察了氧化處理后其分子量、亞單位構象及生物活性的變化。研究發現，隨著氧化時間的增長，mAb-A的分子量逐漸增加，這主要是由于重鏈（HC）上的Met105位點發生了二硫鍵斷裂導致的氧化反應。此外，F(ab')2片段內也發現了兩個對稱位置的氧化敏感位點，這些位點的氧化使得HIC圖譜出現了多個不同的峰組（PG），證實了Met105為主要的氧化位點。進一步研究表明，雖然Met105位點的氧化并不影響抗原結合能力，但它明顯降低了mAb-A對PD-1/PD-L1通路的阻斷活性。
氧化變體分析
Column:
Proteomix HIC Butyl-NP5 (5 μm, 4.6 × 250 mm)
Mobile Phase:
A: 2 M sodium sulfate in tris-base at pH 7.0
B: tris-base at pH 7.0.
Flow Rate: 0.5 mL/min
Temp: 30 °C
Detection: 280 nm
Sample Amount: 30 μg
圖1. mAb-A樣品分析色譜圖
作為mAb-A的參考藥物（RMP），Keytruda在CDR區域含有氧化變異體。為了確保mAb-A的質量和與RMP相似性，研究人員建立HIC方法對樣品進行了分析，結果如圖1所示。圖1中，主峰組（MPG）在大約22 - 27 min，峰前組1（PG1）在大約20 - 22 min洗脫。與MPG相比，PG1的洗脫時間更早。
圖2. mAb-A及其氧化變體分析色譜圖（0.25%的tBHP在0，0.5，4和24h）
為了確認氧化變異體的存在，研究人員在氧化條件下對mAb-A進行了強制降解，隨后使用HIC方法進行了分析，結果如圖2所示。與對照樣品相比，隨著氧化程度的增加，MPG逐漸轉化為PG1，進而轉化為PG2。圖中所示，在氧化0.5 h后，樣品的MPG百分比降低，PG1升高，并觀察到一個新的峰組PG2。在氧化4 h的樣品中，MPG的下降和PG1和PG2的增加更為明顯。在氧化24 h后，MPG和PG1的峰幾乎消失不見，而PG2的峰面積占比達到94%。
表1. LC-MS/MS Trypsin PTM與HIC色譜法結果百分比對比
表1列舉了LC-MS/MS Trypsin PTM結果和從分析HIC色譜法計算出的百分比。兩種方法得出的結果非常接近，表明HIC色譜分析法可以作為一種快速篩查的有效替代方法。
制備收集
Column:
Proteomix HIC Butyl-NP5 (5 μm, 10 × 250 mm)
Mobile Phase:
A: 2 M sodium sulfate in tris-base at pH 7.0
B: tris-base at pH 7.0.
Flow Rate: 2.0 mL/min
Temp: 30 °C
Detection: 280 nm
Sample Amount: 2 mg.
圖3.mAb-A氧化變體HIC分析色譜圖（0.25%的tBHP氧化4 h）
圖3-a.mAb-A氧化變體分級收集
圖3-b.mAb-A氧化變體純度檢測
圖3是對氧化4 h的mAb-A進行分級收集及純度檢測的結果。其中圖3-a是HIC組分收集示意圖。圖3-b表示將富集的樣品超濾三次，然后進行HIC分析來確定各組分的純度。各組分的分析圖譜與制備圖譜對比，可以看出半制備規格Proteomix HIC Butyl-NP5色譜柱保持高分辨率，制備的樣品保持高純度。
實驗結論
綜上所述，研究人員使用賽分科技的Proteomix HIC Butyl-NP5分析與制備柱，成功地對目標抗體mAb-A的氧化變體進行了分離和富集，制備后的樣品可保持生物學活性，可用于后續研究。此方法不僅適用于監測mAb的氧化穩定性，而且在其他mAb的探索性研究和開發過程中也具有廣泛的應用前景。
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