• 高的分辨率和分離效率
• 在高濃度鹽溶液中非常穩定
• 高的重復性
• 可在低濃度鹽溶液中進行蛋白的分離
• 高的蛋白回收率，并可保持其生物活性
• pH適用范圍2-9

　　Nanofilm體積排阻（SEC）固定相是以高純度具有良好機械穩定性的硅膠為基質，表面化學鍵合有一層均一、親水、納米厚度的中性聚合物薄膜。該固定相的一個特點是可使用低鹽濃度，或含有機溶劑的緩沖液作為流動相進行生物樣品的分離，并具有高的分辨率和樣品回收率。該色譜填料為窄粒徑分布的球形硅膠顆粒。孔徑規格有150、250、450和950Å。

高效分離

　　對于生物分離而言，生物分子與填料之間的非特異性相互作用往往會導致低的分離效率，如色譜峰拖尾以及低的回收率等。Nanofilm SEC填料所采用的獨特的表面化學技術可以在硅膠表面共價鍵合一層均勻的聚合物鏈。這種固定相具有中性和親水的性質，因此可以最大限度消除填料基質與生物分子，其中尤其是與蛋白之間的非特異性相互作用。這種經過特別設計的涂層可以使Nanofilm SEC柱獲得高的分辨率和分離效率。例如，以尿嘧啶作為測試物可以獲得高達每米90,000的理論塔板數（見表1）。

表1 Nanofilm SEC柱的柱效，以尿嘧啶為待測物（0.1M磷酸鹽緩沖液，pH7.0）

標準蛋白分離

　　賽分Nanofilm SEC柱高效分離的第一個例子見圖1。四種蛋白質，甲狀腺球蛋白、BSA二聚體、BSA和溶菌酶，以及一種多肽在Nanofilm SEC柱上得到了滿意的分離。以溶菌酶計得到的理論塔板數高至30,000/m，因此溶菌酶中的一種雜質都可以得到很好的分離，而這種分離效果通常只有在高效毛細管電泳中才看得到。SEC柱的標準測試樣品通常為Biorad 標準蛋白（甲狀腺球蛋白、免疫球蛋白G 、卵清蛋白、肌球素）。這些蛋白質的pI均小于7.5，因此在pH=7.0時不會帶有明顯的正電荷。但是高度帶正電荷的蛋白質，如溶菌酶（pI 11.0）、細胞色素（pI 10.6）、抑肽酶（pI 11.0）卻容易與填料表面的殘余硅羥基發生強靜電相互作用而非常難被洗脫。Nanofilm SEC柱不存在這個問題。而且，賽分公司建立了自己的蛋白測試標準樣品，其中就包括了對生物分離性能非常敏感的溶菌酶。

圖1 在4.6mm I.D.×250mm Nanofilm SEC-150柱上分離4種蛋白和一個多肽。

BSA與BSA二聚體的分離

　　從圖2可以看到，Nanofilm SEC-250柱（4.6mm I.D.×300mm），可以獲得牛血清白蛋白（BSA）和BSA雙聚體的分離，其中流動相為150mM的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）。

甲狀腺球蛋白中聚合體的分離

　　甲狀腺球蛋白是一個大分子量蛋白（MW 670,000）。商品化的甲狀腺球蛋白含有聚合體雜質，可能是雙聚體或四聚體。從圖3可以看到，Nanofilm SEC-500可以對甲狀腺球蛋白和甲狀腺球蛋白聚合體實現基線分離。

圖3 用Nanofilm SEC-500柱（5µm, 4.6mm I.D.×300mm）從甲狀腺球蛋白中分離出聚合體。

流動相: 150mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0

流速: 0.35mL/min

檢測波長: UV 214nm

溫度: 室溫（23°C）

進樣體積: 5µL

蛋白樣品: （1）聚合體；（2）甲狀腺球蛋白（1.0mg/mL），670kD

孔結構對分離的影響

　　SEC填料孔徑的大小在蛋白分離中起到至關重要的作用。對于在某一特定分子量范圍內分布的蛋白樣品而言，Nanofilm SEC固定相規格的選擇需要基于填料的排除極限和線性分子量范圍這兩個參數。

圖4 Nanofilm SEC-150、Nanofilm SEC-250和Nanofilm SEC-500柱（5µm, 7.8mm I.D.×300mm）分離效果的比較。

流動相: 150mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0

流速: 0.25mL/min

檢測波長:UV 280nm

溫度:室溫（23°C）

進樣體積:5µL

樣品:（1） 甲狀腺球蛋白（1.0mg/mL）， 670kD；（2）BSA （1.0mg/mL），66kD；（3）核糖核酸酶A（1.0mg/mL），13.7kD；（4） 尿嘧啶（2.5mg/mL），120 D

圖4為具有不同孔徑的Nanofilm SEC柱對分子量在120-670,000之間分布的三種蛋白的分離，從中可以看到Nanofilm SEC填料孔徑的不同對分離的影響。

高的蛋白回收率及蛋白活性的保持

　　Nanofilm SEC填料是在硅膠表面最大限度地共價鍵合一層親水的中性薄膜。蛋白或其它生物分子與這種填料的相互作用非常小。因此，蛋白在硅膠表面的吸附將會被抑制，這就保證了高的回收率，并可使蛋白在分離之后依然有著高的生物活性。表2是實驗測得的酸性蛋白BSA和堿性蛋白溶菌酶的回收率數據。

表2 蛋白在Nanofilm SEC柱上的回收率（色譜柱規格4.6mm I.D.×250mm，流動相為0.15M磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）

Nanofilm SEC固定相的高穩定性

　　Nanofilm SEC固定相具有致密的涂層鍵合密度，因此可阻止任意分子破壞硅膠與固定相之間的鍵合，從而保證填料具有高的穩定性。Nanofilm SEC固定相可用于多種緩沖液中，如醋酸銨、磷酸鹽、Tris等。當用150和100mM的磷酸緩沖液（pH7.0）作為流動相時，在3個月或進樣1000次后Nanofilm SEC柱的性能僅會發生輕微的改變，保留時間的偏差在5%以內。圖5是Nanofilm SEC-150在1、5和10天，每天運行10小時得到的結果。從圖中可以看到流出曲線基本重合。圖6是兩周內蛋白和一個小分子在500倍柱體積內保留時間的變化情況。從圖中可以看到保留時間變化的差異非常小。 Nanofilm SEC固定相可在高鹽濃度，如1.0M下使用。另外，Nanofilm SEC柱在有機溶劑如甲醇、乙醇、THF、DMF、DMSO等中，以及其與水的混和溶液中也相當穩定。 Nanofilm SEC柱在pH 2-8.5范圍內穩定。另外，在短時間內也可以耐受高的pH，如pH 8.5-10。 Nanofilm SEC柱在溫度耐受方面表現突出。最高工作溫度可達到80°C。

圖5 Nanofilm SEC固定相穩定性實驗結果

色譜柱: Nanofilm SEC-150(5µm, 4.6mm I.D.×300mm)

流動相: 150mM和100mM磷酸鹽緩沖液, pH 7.0

流速: 0.35mL/min

溫度:室溫

進樣體積:10µL

樣品:1. 甲狀腺球蛋白(1.0mg/mL)；2. BSA (1.0mg/mL)；3. 核糖核酸酶A(1.0mg/mL)；4. 尿嘧啶(50mg/mL)。每天運行10小時

圖6 三種蛋白和尿嘧啶在500倍柱體積內反復進樣得到的保留時間的變化情況。測試條件同上圖。

蛋白分子量的校正

　　對于SEC而言，填料孔徑的大小決定了所能分離的分子量范圍，而孔體積則決定了分離容量。Nanofilm填料擁有4種孔徑規格，可以覆蓋一個寬范圍分子量分布的生物大分子。圖7是Nanofilm SEC-150、Nanofilm SEC-250和Nanofilm SEC-500的蛋白分子量校正曲線。

圖5 Nanofilm SEC固定相穩定性實驗結果

色譜柱: 4.6mm I.D.´300mm, 填料粒徑為5µm

流動相: 150mM磷酸鹽緩沖液, pH 7.0

流速: 0.25mL/min

檢測波長:214nm

進樣體積:5µL

樣品:1. 甲狀腺球狀蛋白(670kD), 2. IgG(150kD), 3. BSA雙聚體(132kD), 4. BSA (66kD), 5. 卵清蛋白(44kD), 6. 肌紅蛋白(17.6kD), 7. 溶菌酶(14.3kD), 8. B12 (1.35kD), 9. 尿嘧啶(120D)

另一種廣泛使用的表征SEC固定相的方法是以蛋白的分子量對擴散系數（Kd）作圖。Kd按下式定義： Kd = (Ve-Vo)/(VT-Vo) 其中Ve、VT和Vo分別是樣品洗脫體積，色譜柱的總體積和柱的死體積。蛋白分子量和Kd的線性區間經常會被作為SEC固定相選擇的參考。如圖8所示，Nanofilm SEC-150在一個寬的分子量范圍內分子量和Kd之間有著良好的線性關系。

圖8 Nanofilm SEC-150的蛋白分子量校正曲線

色譜柱: Nanofilm SEC-150 (4.6mm I.D.×150mm, 5µm)

流動相: 100mM磷酸緩沖液，pH 7.0

流速: 0.25mL/min

檢測波長:UV 214nm

溫度:室溫（23°C）

進樣體積:5µL

樣品:（1） 甲狀腺球蛋白（670KD）；（2） IgG（150KD）；（3）BSA雙聚體（132KD）；（4 ）BSA（66KD）；（5）卵清蛋白（44KD）；（6）a-胰凝乳蛋白酶（25KD）；（7）肌紅蛋白（17.6kD）；（8）溶菌酶（14.3kD）；（9）多肽樣品（1.5kD）；（10）尿嘧啶（120D）

低鹽濃度下蛋白的分離

　　對于帶正電荷蛋白的分離，往往需要用高鹽濃度來減弱硅膠基質與蛋白之間的強靜電相互作用。比如細胞色素C是一種富含正電荷的蛋白質（pI=9.6），因此很難在低鹽濃度（比如50mM磷酸鹽緩沖液， pH 7.0）下被洗脫出來。使用高鹽濃度洗脫會限制SEC柱在蛋白分離中的應用。賽分公司所開發的Nanofilm SEC柱可以有效地分離帶正電荷的蛋白質。如圖9所示，采用Nanofilm SEC-500柱，細胞色素C可以在50mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中得到很好的分離，而這種分離效果是其它硅膠基質SEC柱所無法實現的。Nanofilm SEC柱的出現為SEC開拓了許多新的應用領域，例如分離對鹽敏感的生物分子，蛋白相互作用的研究，以及LC/MS檢測等。

圖9 細胞色素C在不同磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中的流出曲線

色譜柱: Nanofilm SEC-250柱(5µm, 4.6mm I.D.×300mm)

流速: 0.35mL/min

檢測波長:UV 214nm

溫度:室溫（23°C）

進樣體積:5µL

樣品濃度:1.0mg/mL

SRT SEC和Nanofilm SEC的比較

　　與Nanofilm SEC相比，SRT SEC具有更高的分離容量和分辨率，可供選擇的孔徑規格也要比前者多。但是，Nanofilm SEC在一些應用，如使用低鹽濃度或含可揮發性鹽的有機溶劑作為流動相進行富含正電荷生物分子的分離，多維色譜分離，以及LC/MS等中表現得更為穩定，而這是傳統SEC固定相所無法實現的。另外，SRT和Nanofilm SEC固定相也具有不同的選擇性。SRT和Nanofilm SEC固定相可以組合起來使用，從而可為生物分子，水溶性聚合物，病毒和細菌，以及納米顆粒等的分離提供一個完整的分離方案。