重組膠原蛋白是采用基因工程技術在合適的宿主中表達并翻譯的蛋白或類似膠原蛋白的多肽，相對于天然提取的膠原蛋白，具有批次間穩定、組分可控、生物安全性高和可編輯修飾等優點，廣泛應用于美容護膚，皮膚、眼科修復與骨修復等醫學保健領域。據行業研究報告顯示，我國重組膠原蛋白市場預計到2027年將達到千億規模。重組膠原蛋白行業已成為功能性護膚市場、醫用敷料市場的黃金賽道。
背景簡介
膠原蛋白由脯氨酸、甘氨酸以及羥脯氨酸等構成一級結構，氨基酸通過α螺旋使膠原蛋白二級結構趨于穩定，最后3條α鏈經過左手螺旋構象形成三螺旋結構的原膠原，如圖1展示。根據國家藥監局對外發布的《重組膠原蛋白生物材料命名指導原則》，可將重組膠原蛋白分為 3 類：①重組人膠原蛋白；②重組人源化膠原蛋白（醫療器械中最主流的重組膠原蛋白類型）；③重組類膠原蛋白（主要用于化妝品領域）。《重組人源化膠原蛋白》行業標準（YY/T1888-2023）文件對重組人源化膠原蛋白的質量控制給出了明確的指導，對于宿主細胞蛋白質（HCP）殘量、細胞內毒素等雜質要求提供了明確的質檢標準。
圖1. 膠原蛋白結構的形成*
重組膠原蛋白的常見表達體系為大腸桿菌和酵母，大腸桿菌表達體系具有遺傳背景清晰、發酵成本低、生產周期短和效率高等優點，酵母表達體系具有安全性高、發酵成本低和產量高等優勢。賽分科技根據兩種表達體系特點開發了大腸桿菌體系純化方案和酵母體系純化方案，助力重組膠原蛋白企業實現高品質、高效率的規模化生產。
大腸桿菌體系純化方案
大腸桿菌表達體系中的主要雜質是細胞代謝產生的宿主蛋白、宿主核酸以及內毒素等，常用親和層析、離子交換層析等方法去除。如圖2的工藝示意圖，對于胞內可溶表達的目標產物，首先將菌體進行破碎、澄清過濾等樣品前處理；對于有His標簽的表達產物，一般選擇Ni親和層析進行目標產物的捕獲，待酶切切除標簽后，可采用流穿模式再用Ni親和層析去除His標簽、未酶切的蛋白等；精純則采用離子交換去除內毒素等雜質，同時進一步提升樣品純度。賽分科技瓊脂糖基質的Ni親和填料Agarosix MC90-NTA Ni具有高載量、高回收率的特點，適用于含His標簽的重組蛋白的捕獲以及酶切后去除標簽，配合陰離子交換填料Monomix Mab60-Q，有效純化重組人源化膠原蛋白，得到滿足質量要求的目標蛋白樣品。
圖2. 大腸桿菌體系制備重組膠原蛋白工藝示意圖
親和捕獲應用案例
某重組人源化膠原蛋白樣品，表達體系為大腸桿菌，分子量約為70 KDa。經Agarosix MC90-NTA Ni純化后，從圖3電泳圖可知，流穿液、洗雜、再生中的含有極少的目的蛋白，一步回收率在90%以上，洗脫峰（lane 6）實現了目的蛋白的富集，有效去雜蛋白，純化后樣品純度顯著提升。
圖3. Agarosix MC90-NTA Ni純化圖譜和電泳圖
（1. Marker; 2.原樣; 3. FT; 4. Wash1; 5. Wash2; 6. Elution; 7. CIP）
酵母體系純化方案
畢赤酵母作為一種真核表達系統具有目的蛋白表達量高、純化方法簡單、不受內毒素影響等特點，是膠原蛋白重組表達的優勢宿主菌株。下游純化時可通過離子交換層析捕獲結合疏水層析精純，得到高純度重組膠原蛋白產物。賽分科技推薦Agarosix MC90-MMC復合陽離子交換填料或Monomix HC60-SP陽離子交換填料捕獲，結合Polar MC30-HIC Phenyl疏水填料精純，兩步純化后目的蛋白SEC純度在95%以上，滿足實際生產需求。
圖4. 酵母體系制備重組膠原蛋白工藝示意圖
應用案例
對某重組人源化膠原蛋白發酵液進行下游純化，首先用Agarosix MC90-MMC填料進行陽離子交換層析，捕獲目的蛋白，之后用Polar MC30-HIC Phenyl進行疏水層析精純，兩步純化后SEC純度達到97%，電泳純度達到99%。
01 MMC捕獲方案
Agarosix MC90-MMC陽離子交換層析捕獲目的蛋白，如圖5純化圖譜及電泳圖，流穿液（lane 3）中基本無目的蛋白，洗雜后大分子雜蛋白被成功去除（lane 4），僅剩余少部分降解片段和小分子雜質（lane 5），洗脫后的目的蛋白純度明顯提升且收率較高。
圖5. Agarosix MC90-MMC純化圖譜及電泳分析
（1. Marker; 2.原樣; 3. FT; 4. Wash; 5. Elution）
02 疏水層析精純方案
捕獲后的樣品用Polar MC30-HIC Phenyl進行疏水層析精純，小分子雜質與目的蛋白分開完全，洗脫合管（lane 5）的SEC純度達到97%，電泳純度達到99%，雜蛋白幾乎完全去除。
圖6. Polar MC30-HIC Phenyl純化圖譜及電泳分析
（1. Marker; 2.原樣; 3. FT；4. Wash; 5. Elution合樣）
小結
Agarosix MC90-NTA Ni填料的蛋白載量高，具有良好的化學穩定性，配合Monomix Mab60-Q陰離子交換填料，有效純化大腸桿菌體系重組人源化膠原蛋白（點擊鏈接閱讀，了解更多Agarosix MC90-NTA Ni產品信息）。酵母體系推薦Agarosix MC90-MMC復合陽離子交換填料捕獲和Polar MC30-HIC Phenyl疏水填料精純，兩步純化后目的蛋白SEC純度在95%以上，滿足高純度、高收率的生產要求。
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*參考文獻：
[1] BERISIO R, et al. Crys tal structure of the collagen triple helix model [(Pro-Pro-Gly)10]3 [J]. Protein Science, 2002, 11(2): 262-270.
[2] 潘家豪, 等. 重組膠原蛋白表達體系研究進展[J]. 合成生物學, 2023, 4(04): 808-823.
[3] 徐蘭舉, 等. 重組人源Ⅲ型膠原蛋白在大腸桿菌中的表達與純化工藝[J]. 南開大學學報（自然科學版），2024, 57(03): 40-45.
